G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCR）是高等真核生物中广泛存在的感知和传感实体，在细胞信号传导以及免疫调节中发挥着重要作用。通过利用GPCR的显著传感能力以及真核微生物酿酒酵母的遗传特性来构建生物传感器可用于化学物质、细菌、病毒和疾病的检测，并且因其成本和便携等特性，可应用到多种不同酿酒酵母生物传感器开发中。然而对于生物传感器的性能而言，灵敏且可靠的输出至关重要，尤其是对于目标分析物可能以痕量浓度存在的低成本应用。因此，迫切需要一种广泛适用的策略来提高基于酵母GPCR的生物传感器的检测限和信号输出，以满足实际使用的要求
近日，厦门大学袁吉锋教授团队在Biosensors and Bioelectronics杂志上发表了一篇题为“Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens”的研究论文。该论文在酿酒酵母中将GPCR信号通路与半乳糖调节 (GAL) 系统耦合，并实施正反馈环路以增强酵母生物传感器在真菌检测方面的性能。证明了级联放大电路可以显著改善工程化酵母生物传感器，具有更好的灵敏度和信号输出幅度，这将为它们在公共卫生领域的实际应用铺平道路。
研究人员前期在酿酒酵母中利用GPCR 信号级联来重塑具有不同表达谱的酵母半乳糖调节子，展示了基于GPCR系统的可塑遗传装置可能为未来的代谢工程和生物传感器应用带来巨大的希望。而GPCR系统在细胞信号转导中发挥着至关重要的作用，已被广泛用作酵母的传感元件生物传感器开发。因此研究人员在前期研究基础上通过人工转录因子（synthetic transcription factor，sTF）将GPCR信号通路与半乳糖调节（GAL）系统连接起来（Cell Reports Methods, 2023, 3, 100647），引入了正反馈回路进一步增强酵母传感器的性能，从而开发模块化酵母生物传感器，可低成本、灵敏且快速地检测病原真菌。
首先，GPCR信号机制本质上是可模块化的，研究人员基于前期工作半乳糖调节 (GAL) 系统通过人工转录因子与信息素感知的 GPCR 信号通路耦合，重塑了MAPK控制的转录因子，将输出模块重定位为半乳糖系统。通过使用来自病原真菌白色念珠菌的异源GPCR取代酵母天然Ste2受体调整GPCR蛋白的输入模块，重构的酵母生物传感器可感知来自病原真菌的外来信息素并触发信号转导以诱导GAL系统下报告基因的表达（图1）。
级联放大在传感器设计中可实现感知信号放大以及输出信号的增强，因此研究人员在工程化酵母生物传感器中引入一个额外的正反馈回路来增强灵敏度和信号输出。具体的是，设计了一种正反馈放大器，即可自响应的GAL系统控制下的Gal4表达盒组成（图2）。感知真菌信息素后，传感器系统除了控制报告基因的sTF之外，还包含额外的转录放大层，sTF 驱动Gal4转录激活剂的转录，从而进一步放大源自sTF的信号，以提高生物传感器的灵敏度和输出幅度。为了评估级联放大生物传感器的性能，使用不同梯度浓度的病原真菌白色念珠菌的信息素对其进行了测试，在同步敲除酿酒酵母GPCR系统的负反馈因子Sst2之后，级联放大生物传感器可具备灵敏的检测性能，相比于初始传感器，检测限（LOD）提升了4000倍（从1 nM提升至0.25 pM），半最大有效浓度（EC50）提升了9700倍（从32.55 nM到3.323 pM）（图3），此外，信号级联的设计延长了剂量持续时间，即使在低剂量的信息素刺激下也能产生持续且显着的信号输出。且利用传感器信号感知-信号输出关系可进行信息素的定量分析。
此外，为了进一步确定传感器的性能，研究人员还尝试探究温度、pH以及迭代培养对传感器的性能影响，结果表明，基于GPCR的酿酒酵母传感器具有明显的稳定性以及精确性（图3）同时为了满足未来的传感器实际应用，研究人员采用比色测定而不是依赖荧光信号来设计视觉输出模块，结果表明工程化酵母生物传感器可以通过信号级联放大来检测真菌信息素，并产生肉眼可以捕获的强烈信号输出。
总之，这项研究成功地利用酵母中的级联信号放大器来增强生物传感器在检测限、动态范围和输出幅度方面的性能。级联信号放大使工程化酵母生物传感器能够在病原体检测中提供更好的灵敏度和良好的可靠性。未来信号受体通过多个级联信号放大的信号转导和信号输出模块的组合优化将最终实现众多具有实际应用价值的生物传感器开发。
图1：基于GPCR的酿酒酵母工程化传感器
图2：正反馈放大器提高工程化生物传感器的性能
图3：高灵敏度检测和定量分析的工程化生物传感器。
厦门大学细胞应激生物学重点实验室袁吉锋教授为该论文的通讯作者，第一作者为博士研究生范聪，第二作者何妮珂为“英才计划”中学生。该研究得到了国家自然科学基金（32270087）、达安基因等经费的资助。
论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566324000617
（图/文 袁吉锋课题组）